Terapia Epigenómica en la enfermedad de Parkinson

Tema: Epigenoma aberrante en neuronas dopaminérgicas inducidas de pacientes de Parkinson 

Mecanismo epigenómico tratado: Metilación del ADN, y neuronas dopaminérgicas de pacientes con mutación en el LRRK2

Como se lo hizo: 

Se genero DAN inducidas a partir de células somáticas de pacientes de EP incluyendo 4 pacientes con EP-LRRK2 causada por la mutación G2019S, 6 pacientes con EP esporádica y 4 controles sanos

Para generar DAN

Biopsia de piel en el brazo de los sujetos y aislamiento de fibroblastos

Reprogramación celular de fibroblastos a células madre pluripotentes inducidas (iPSC) mediante transducción retroviral de factores de reprogramación (OCT4, SOX2, KLF4) 

Diferenciación de iPSC a DAn mediante la transducción lentiviral del determinante dopaminérgico LMX1A

Resultados: 

Se encontramos que los enhancers hipermetilados en EP mostraban enriquecimiento en lugares de unión de 23 factores de transcripción 

Se halló una relación inversa entre niveles de metilacion de enhancers y expresión de 4 FT relacionados con la EP (FOXA1, NR3C1, FOSL2 y HNF4A)

Se identificaron en la trascripción del ADN 437 genes diferencialmente expresados en la EP sin diferenciación de la expresión entre EP-LRRK2 y EP esporádica

Bibliografia

1.- https://genotipia.com/genetica_medica_news/neuronas-dopaminergicas-parkinson/

Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos en la enfermedad de Parkinson

Generación mediada por CRISPR/Cas9 de minipigs Guangxi Bama que albergan tres mutaciones en α-sinucleína que causan la enfermedad de Parkinson

TIPO DE EDICIÓN: in vivo - células somáticas 

DIRIGIDOS HACIA: ADN genómico, ARN total resultante de la codificación del ARNm, gen SCNA

DIRIGIDOS POR: CRISPR/Cas9 enzimas de restricción de BmgBI, sgRNA empleado en el vector pMD18-T (3k bp), utilizando un ligasa de ADN T4 para el exón 3 de SCNA (E46K, H50Q y G51D).

USO DE VECTORES: pMD18-T

ÓRGANO/CÉLULA A TRATAR: fibroblastos de minipig guangxi bama recién nacidos por co-transfectado en fibroblastos a través de la transfección Xfect.

Clonación de embriones por SCNT 

VÍA DE ADMINISTRACIÓN: por inyección intraperitoneal

RESULTADOS:

Resultados a Corto Plazo: Generamos con éxito un total de ocho minipigs Guangxi Bama derivadas del SCNT con las mutaciones de HETEROCIGOUS SCNA deseadas integradas en el genoma

Resultados a Mediano Plazo: Confirmamos por secuenciación de ADN que estas minipigs expresaban α-sinucleina mutante a nivel de transcripción.

Resultados a Largo Plazo: El análisis inmunohistoquímico no fue capaz de detectar cambios patológicos específicos de la PD, como la patología α-sinucleina-inmunopositiva y la pérdida de neuronas dopaminérgicas de SN en las minipigs editadas por genes a los 3 meses de edad.

Bibliografía 

1.- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6102220/

Terapia Regenerativa de la enfermedad de Parkinson

Terapia basada en células iPS para la enfermedad de Parkinson: un ensayo en Kioto

Tipo de Stem Cell:  iPS células madres pluripotenciales inducidas (CMPI) 

Genes: SOX1, PAX6, QHJI-01 y marcadores específicos de placa de piso, CORIN (TRA-1-60, TRA-2-49/6E, SSEA-4) (1)

Método de obtención:  Cultivar las células humanas del donante anónimo a partir de un tipo de  haplotipo de antígeno leucocito  DRB1 que coincide con el 17% de la población japonesa, luego se llevó a cabo ensayos de esterilidad, micoplasma y endotoxina de acuerdo con los estándares japoneses, después reprogramen a células pluripotenciales y Diferenciar a células neuronales productoras de dopamina. (1)

Vía de administración: Se implanto en un modelo primate de PD (Macaca fascicularis)tratada con la neurotoxina MPTP. (2)

Resultados: a corto plazo Se puede observar que el trasplante celular mejore los síntomas aumentando la cantidad de neuronas dopaminérgicas, pero la progresión de la enfermedad no se puede detener. a mediano plazo se aceptó realizar ensayos clínicos con células iPS para mejorar la EP y a largo plazo se espera mejorar los síntomas y detener la progresión de la enfermedad para un tratamiento completo para la EP (1)

Bibliografía

1.- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7794047/

2.- https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28858313/ 

Animal transgénico para la enfermedad de Parkinson

Tema: La sobreexpresión inducida por AAV1/2 de A53T-α-sinucleína en la sustancia nigra, un nuevo modelo de ratón transgénico para la enfermedad de Parkinson.

Tipo de animal transgénico:  Ratones machos de tipo salvaje (wt) en C57BL/6. Knock in

Al ser modificable a la manipulación genética, se inyectaron AAV1/2-A53T α-sinucleína unilateralmente en el SN derecho de los ratones

Usos:  Demostrar que la inyección unilateral de AAV1-2 que contiene A53T-aSyn mutado en humanos en el SN indujo una sobreexpresión generalizada de A53T-aSyn en neuronas de SN dopaminérgicas que condujeron a neurodegeneración, pérdida de fibra dopaminérgica y disminución del neurotransmisor dopaminérgico en el estriado dentro de 10 semanas. Además, la degeneración del sistema nigrostriatal indicida a la insuficiencia motora. Detección de patología de Lewy por digestión de proteinasa K y aplicación de anticuerpos específicos elevados contra el cuerpo humano de Lewy α-sinucleína

Métodos por el cual fue obtenida:

• El vector de sustitución se introduce mediante un microinyector
• La inmunofluorescencia 
• Tinción simultánea con muestras humanas de PD SN
• Cuantificación de catecolaminas por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
• Tinción immunhistoquímica para aSyn con anticuerpo LB509

Bibliografía 

1.- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5286802/

VENTAJAS 

• Los animales transgénicos representan un valioso aporte a la ciencia, permitiendo realizar ensayos de seguridad de vacunas y fármacos.
• Mejores tratamientos, terapias y procedimientos diagnósticos para las enfermedades.
• Mejoran la investigación básica, facilitando un mayor entendimiento en los mecanismos de funcionamiento y control de los genes.
• Aportan valor en la donación de órganos y tejidos
• En el caso de las plantas, ofrece resistencia a plagas, enfermedades y tolerancia a herbicidas.

DESVENTAJAS 

• Los animales y plantas transgénicos, puede provocar la aparición de alergias de un organismo a otro por la expresión de nuevas proteínas. 
• Violación del valor intrínseco de los organismos naturales.
• Pérdida de biodiversidad en flora y fauna.
• Biopiraterí­a o explotación extranjera de recursos naturales.
• Interferencia con la Naturaleza al mezclar genes podemos poner en riesgo especies autóctonas.

bibliografía

1.- https://www.agroempresario.com.ar/notas-9472.html

2.- https://www.salmonexpert.cl/article/los-animales-transgenicos-podrian-mejorar-el-bienestar-animal/

ADN recombinante artificial de la enfermedad de Parkinson

Con el fin de estudiar nuevas vías moleculares se desarrolló nuevas estrategias terapéuticas para la EP por medio de la tecnología del ADN recombinante, que puede ser aplicada en las células vivas para producir y diseñar proteínas tanto In vivo como In vitro. Hay varias proteínas que se agregan y forman parte de los Cuerpos de Lewy, pero alfa-Sinucleína (aSyn) pareciera ser la mayoritaria en los casos de Parkinson, Aún no se le ha podido asociar una función específica a la aSyn .recombinante  Sabemos cómo se comporta in vitro (en un tubo de ensayo), asociándose a membranas de fosfolípidos o micelas de detergentes, por lo que se cree que sus funciones principales estarían asociadas al transporte de vesículas en el citosol, ya sea entre retículo endoplásmico y distintos sacos del Golgi, la membrana plasmática y endo/lisosomas.

Bibliografía 

1.- http://www.faba.org.ar/fabainforma/535/Actualidad01.htm

ADN Recombinación en la naturaleza

Plásmidos.- Son moléculas de DNA constituyentes de doble cadena extracromosómica de origen natural. Tienen un origen de replicación (ori+) lo hacen autónomamente en las células bacterianas. El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos diseñados que se utilizó en DNA recombinante. Este plásmido tiene un origen de replicación (ori+), dos genes de selección (resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de restricción únicos.

Bibliografía

1.-https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6728730/

Técnica de secuenciación masiva para la enfermedad de Parkinson

La nueva generación de secuenciación masiva, provee una forma de investigar la base genética de las enfermedades neurodegenerativas, obteniendo miles o millones de fragmentos de ADN en un único proceso de forma paralela, haciendo posible la secuenciación en corto plazo. En un estudio realizado se utilizó la plataforma de secuenciación NGS, en 28 pacientes con antecedentes familiares y 14 pacientes con  EP. Se identifico una variante de secuenciación demostrando que el aumentando de la expresión y la toxicidad de la α-sinucleína en las células neuronales dopaminérgicas. Por lo tanto, esta variante podría contribuir a la EP.

Bibliografía 

1.- http://www.scielo.org.co/pdf/unmed/v61n2/0041-9095-unmed-61-02-00049.pdf

2.- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0716864016300347

PCR para la Enfermedad de Parkinson

En un análisis, se muestra una PCR especifica con el método (RT-PCR), capaz de amplificar genes diferenciados como el gen SNCA y exclusivamente una muestra de PCR cuantitativa con el método (RT-qPCR) para el gen PSEN1, con el fin de establecer la detección simultanea de cuatro variantes asociadas con este gen. En otros estudios se han demostrado que las mutaciones en el gen PSEN1, reduce drásticamente la actividad de las neuronas dopaminérgica que es el factor de riesgo importante para la EP. y esta prueba PCR hace  posible que los pacientes tengan un acceso temprano acerca de la EP y puedan ir a terapias personalidades. 

Bibliografía

1.- http://www.scielo.org.pe/pdf/rins/v32n4/a23v32n4.pdf